生物转化罐。
■本报记者 李晨 实习生 杨晨
对于工业细菌“大肠杆菌”来说，三羧酸循环在其有氧生长过程中发挥着重要作用——将碳源转化为细胞生物量。但将碳通量从细胞生长转移到工业界感兴趣的产物上会干扰天然代谢，并可能影响碳效率。
理论上，阻断三羧酸循环及其旁路就可以减少碳耗散，不过，三羧酸循环的阻断往往会干扰细菌的自然生长。
中国科学院微生物研究所研究员陶勇团队设计出一种全新的具有不完整三羧酸循环的大肠杆菌底盘细胞，使有氧发酵的碳损失降到最低。近日，相关论文发表于《自然-通讯》。
“有了这个底盘细胞，所有α酮戊二酸依赖型的酶催化反应都可以得到优化，可以说是‘一石多鸟’。”论文共同通讯作者陶勇说。
一个具有挑战性的决定
三羧酸循环是需氧生物体内普遍存在的代谢途径。它将有机物质分解为二氧化碳和水，同时产生大量高能分子，是糖类、脂类和氨基酸的最终代谢通路。
论文共同通讯作者、中国科学院微生物研究所项目研究员林白雪告诉《中国科学报》：“三羧酸循环是好氧生物生命中必需的循环。我们在这项研究中打断了三羧酸循环，这是一件很有挑战的事。”
关于这项研究的起源，要追溯到10年前。2013年，青霉素由于易造成过敏而渐渐淡出患者的选择范围，但当时我国青霉素产能犹在。
一向关注产业的陶勇注意到，不易引起过敏的头孢菌素与青霉素的结构相差不大。如果能将青霉素转换为头孢菌素，一方面能够解决青霉素滞销问题；另一方面也能用生物合成取代原本生产工艺中的化学反应，减少重金属污染。
“有一种酶可以将青霉素转换为头孢菌素的母核，这种酶天然的作用对象是青霉素N，而我们生产的是青霉素G。”陶勇介绍说，“当时，中国科学院微生物所研究员杨克迁虽然提高了酶对青霉素G的亲和力，但催化能力还是很低。”
陶勇团队研究发现，要提升这个酶的催化能力，共底物α酮戊二酸是另一个必需品，而α酮戊二酸是三羧酸循环的中间代谢产物。但其通过外源添加的工艺成本太高，如何绿色高效地向青霉素到头孢的催化反应中供应α酮戊二酸，成为难题中的难题。
“既然外源行不通，那就试试内源。”陶勇说，α酮戊二酸在青霉素到头孢的催化反应中会生成琥珀酸，而在三羧酸循环中，α酮戊二酸同样会生成琥珀酸。该团队由此设想，如果能让三羧酸循环中的α酮戊二酸在催化反应中转化为琥珀酸，不就解决内源供应问题了吗？
基于此，研究人员将三羧酸循环中α酮戊二酸到琥珀酸的通道断开，把青霉素到头孢的酶催化反应偶联到循环之中，这样既能在细胞正常生长的同时为酶提供必需的共底物，又解决了α酮戊二酸依赖型的一系列酶的催化能力不足问题。
“我们当时只改了这一步，就把酶催化效率提高了11倍。”林白雪说。2015年，该研究成果发表于美国《国家科学院院刊》。
适者生存的“聪明”细胞
然而，新的挑战又出现了。陶勇回忆道：“三羧酸循环断了之后，细胞只能在实验室提供的营养丰富的牛肉膏蛋白胨培养基中生长，一旦移到工业生产所用的无机盐培养基中就不长了。”
对此，陶勇团队开始进一步探索工业化路径。
自然界中有些微生物天生不具有三羧酸循环，但也能在有氧条件下生存。这让论文第一作者、当时在中国科学院微生物研究所读博的周航兴奋起来——是否可以通过人为进化，让切断三羧酸循环的菌调节自身来适应无机盐环境呢？
周航继而开展了为期11周的适应性进化实验。“我们先把没有完整三羧酸循环的菌放在牛肉膏蛋白胨培养基中生长，看到有菌长起来后再把它整体稀释10倍，取其1/10转接到葡萄糖培养基里。我们经过45轮循环之后发现，没有完整三羧酸循环的菌能够在无机盐培养基中正常生长。”随后，团队成员开始着手基因组分析。
2017年，在美国特拉华大学教授Maciek R. Antoniewicz的帮助下，陶勇团队根据碳13代谢流数据分析，终于发现了不完整三羧酸循环下细胞仍能正常生长的奥秘——在细胞中央代谢提供的12个分子中，α酮戊二酸、草酰乙酸和丁二酰辅酶是三羧酸循环所必需的。
“通过代谢流分析可以发现，除去人工阻断循环的地方，还有两处没有流量通过，并且正常的三羧酸循环是顺时针流动的，进化后的菌中有一步是逆时针流动。”陶勇告诉《中国科学报》，“细胞很聪明，我们不让它从这边走，它要活下去就只好掉转方向，突变另一步反应，以此维持琥珀酰辅酶A的产生。”
于是，他们在实验室里实现了让不完整三羧酸循环的细胞在无机盐培养基中生存。
实现高价值化学品的生物制造
从设计到进化再到解析，是一个成熟的研究发现。但周航并不满足于此。
“大肠杆菌与很多好氧微生物一样，‘吃’进去的葡萄糖在三羧酸循环中会转化为二氧化碳。”周航说，二氧化碳的排放减少了直接用于产品合成的碳通量，从而对产品产量产生负面影响。因此，阻断三羧酸循环及其旁路可以减少碳耗散，促进好氧发酵中的化学生物合成。这是科学家一直想要解决的提高有氧发酵生产效率的问题。
有没有办法让细胞不需要琥珀酰辅酶A，就能在工业化生产中提高生产效率？
“将外源乙酰辅酶A依赖途径引入大肠杆菌中，使大肠杆菌不需要依赖琥珀酰辅酶A。”林白雪说，他们发现，改造后的大肠杆菌在三羧酸循环缺失的情况下，在无机盐中长得很好。
研究团队构建了一种没有功能性三羧酸循环的大肠杆菌菌株，该菌株可以作为化学物质生物合成的通用底盘。利用这个底盘细胞，他们实现了4种不同化学品的生物合成，提高了产物转化率。
该团队又进一步以左旋肉碱生物合成为突破口，利用上述工业底盘细胞构建微生物细胞工厂，实现了左旋肉碱的绿色高效生物制造。
左旋肉碱是人体内天然存在的一种类氨基酸物质，被广泛应用于食品添加剂、饲料添加剂、药物治疗等多个领域，预计2025年其市场规模将达到2.5亿美元。
“左旋肉碱项目转化的实现，说明这个底盘细胞可以‘一石多鸟’，实现了研发的闭环。”林白雪说。
陶勇表示，该研究成果不仅打破了从实验室到产业化的关键瓶颈，更为微生物发酵减碳提供了新思路。未来，这座绿色高效的“细胞工厂”将会陆续赋能多种化学品合成。
相关论文信息：
https://doi.org/10.1038/s41467-024-46655-4
陶勇论文生物微生物
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